超分辨显微镜对样品制备的光学质量和化学稳定性要求极高，制备成败直接决定成像效果。
一、总体原则
原则 | 要求 |
平整度 | 任何不平整导致像差，破坏定位精度 |
纯净度 | 灰尘、纤维、划痕产生严重背景噪声 |
稳定性 | 样品须耐受数分钟至数十分钟的高精度成像 |
荧光团匹配 | 不同技术对荧光团亮度、耐光性有特殊要求 |
二、三大技术的样品制备要点
技术 | 核心原理 | 关键样品要求 |
SMLM（STORM/PALM） | 单分子闪烁定位 | ①GLOX缓冲液触发闪烁；②Alexa 647/Cy5等光转换染料；③化学固定+抗漂移；④折射率匹配（1.515） |
STED | 环形损耗光缩小发射区 | ①Atto 647N等强耐光染料；②样品<10µm；③抗淬灭封片剂；④#1.5盖玻片（0.16-0.19mm） |
SIM | 结构光解调高频信息 | ①高信噪比（强信号低背景）；②极低光漂白（Alexa 488/568/647）；③样品<20µm；④形态稳定 |
三、通用操作流程
Step 1：盖玻片清洁（*关键）
1M KOH或20% HCl超声20min → 去离子水冲洗 → 乙醇超声 → 氮气吹干。推荐等离子清洗机，绝对避免干擦。
Step 2：样品制备
细胞：种在#1.5H盖玻片上，50-80%融合度
组织：薄切<50µm（STED/SIM要求<20µm）
固定：4% PFA + 0.1%戊二醛，避免甲醇固定
Step 3：免疫染色
封闭：10% BSA + 5%山羊血清，1小时。二抗须用纯化、无聚集的荧光偶联二抗（推荐纳米粒偶联）。洗涤：3×10min PBS+0.1% Triton X-100。
Step 4：封片（*易忽视）
技术 | 封片剂 | 注意事项 |
STED/SIM | Prolong Diamond / Mowiol | 避光、4°C固化，无气泡 |
SMLM | STORM专用缓冲液（GLOX） | 新鲜配制，指甲油密封防氧气，成像前制备 |
四、故障排除
问题 | 原因 | 解决方案 |
信号弱/快速漂白 | 染料不耐光、封片剂无抗淬灭 | 换Atto/Star系列；用Prolong Diamond；降功率增曝光 |
高背景 | 封闭不足、抗体聚集 | 增加BSA浓度；用纯化二抗；甘氨酸淬灭 |
分辨率不达标 | 盖玻片厚度不对、样品太厚 | 用#1.5H盖玻片；折射率匹配液；减薄样品 |
SMLM闪烁差 | 缓冲液失效、氧气进入 | 新鲜GLOX；加强密封；优化染料密度 |
SIM条纹伪影 | 样品移动、散射 | 固定样品；用Hessian去噪算法 |
五、快速决策表
技术 | *佳厚度 | 推荐染料 | 关键封片剂 |
STED | <10µm | Atto 647N, Star 635P | Prolong Diamond |
SMLM | <5µm | Alexa 647, Cy5 | GLOX缓冲液+密封 |
SIM | <20µm | Alexa 488/568/647 | Prolong Diamond |
建议：正式实验前，用Tubulin/Actin对照样品验证系统状态。样品制备细节决定超分辨成像的天花板。
